在进行Gateway克隆时，在PCR产物两端引入的attB1和attB2位点的具体序列是什么？
请查看使用Clonase II的Gateway技术手册第13页获取所需信息。
如何纯化attB-PCR产物？
在得到attB-PCR产物之后，我们建议对产物进行纯化以去除PCR缓冲液，残留的dNTP，attB引物，以及attB引物二聚体。引物和引物二聚体在BP反应中会高效的与供体载体重组，因而会增加转化E. coli时的背景，而残留的PCR缓冲液可能会抑制BP反应。使用酚/氯仿抽提，加醋酸铵和乙醇或异丙醇沉淀的标准PCR产物纯化方案不适合对attB-PCR产物进行纯化，因为这些实验方案通常仅能去除小于100 bp的杂质，而在去除较大的引物二聚体时效果不佳。我们推荐一种PEG纯化方案（请参见使用Clonase II的Gateway技术手册第17页）。如果使用上述实验方案您的attB-PCR产物仍然不够纯，您可以进一步对其进行凝胶纯化。我们推荐使用Purelink Quick 凝胶纯化试剂盒。
使用BP克隆可以将多大的PCR片段和pDONR载体重组？对于TOPO-接头的入门载体也是一样吗？
理论上，pDONR载体在BP反应时对插入片段没有大小的限制。我们自己测试过的最大片段是12 kb。TOPO载体对插入片段大小更敏感一些，要获得较高的克隆效率其插入片段长度的上限是3-5 kb。
我可以克隆到pDONR载体上的插入片段最大和最小长度是多少？
我们自己成功克隆进pDONR载体的最小插入片段是70bp，最大是12 kb。虽然成功克隆50-200 bp小片段和序列有一定的关系，但是有文献显示非常小的插入片段（约30 bp）不能被有效克隆（Cheo et al., Genome Research, 14:2111-2120）。
我可以使用pDONR201和pDONR207作为供体载体吗？
可以使用pDONR201和pDONR207，但是尽管pDONR201和pDONR207都含有pUC复制起始点，它们的复制效率却低于我们提供的pDONR221和pDONR/Zeo供体载体，这导致质粒的产量较低。使用pDONR221时，质粒的产量范围是每毫升菌液0.5 - 1.0 µg DNA。
pDONR221和pDONR/Zeo载体之间的区别在哪里？
pDONR221和pDONR/Zeo载体的骨架完全相同，除了抗生素抗性标记不同。pDONR221带有卡那霉素抗性标记，而pDONR/Zeo带有Zeocin抗性标记。
BP反应需要多少DNA？
要实现最高效的BP反应，最好要使attB位点的摩尔数不要超过attP位点的。标准的BP反应（20 µL）使用300 ng (不超过500 ng)的pDONR载体和30-300 ng两侧带attB位点的PCR产物或表达克隆在25摄氏度孵育1小时。在反应中使用过多的供体载体将抑制BP反应并且会导致完整的供体载体和入门载体共转化。这将降低平板上的克隆数，因为ccdB基因的存在会杀死转化后的E. coli。将孵育时间延长至24小时可以将更大比例的起始attB-DNA转化为产物。对于> 4 kb的PCR产物，每fmol PCR DNA获得的克隆数随着片段大小的增加而下降。因此，对于较大的PCR产物，我们推荐将每20 µL反应的PCR产物用量提高到至少100 fmol，并使用超过1小时的孵育时间（例如6小时或孵育过夜到24小时）。我们自己克隆过的最大PCR片段是10.1 kb。将孵育时间延长至4-6小时通常会将克隆产出提高2-3倍，而孵育时间延长至16-24小时会将克隆产出延长5-10倍。
我忘了向BP反应中加入蛋白酶K。我可以继续吗？
您可以继续，但重组效率将降低大约10倍。
我应该使用什么样的感受态细胞来扩增供体载体和目标载体？在BP或LR重组反应之后我应该用什么样的感受态细胞呢？
所有供体载体和目标载体均含有ccdB细胞致死基因以降低非重组BP/LR质粒的背景。因此，扩增非重组质粒需要使用对ccdB致死作用具有抗性的特殊细胞（One Shot ccdB Survival 2 T1R感受态细胞）。另一方面，通用的E.coli克隆菌株，包括TOP10或DH5a，可以用于BP或LR反应转化，或用于扩增和维持重组后的Gateway重组子。
我可以同时在同一试管中进行BP和LR反应吗？
不行，因为LR Clonase中的Xis蛋白抑制BP反应。但是，您可以顺次进行这两个反应。
BP Clonase和BP Clonase II之间有什么区别？LR Clonase和LR Clonase II之间呢？
BP Clonase和LR Clonase分别带有5X BP反应缓冲液或5X LR反应缓冲液，包装于单独的试管中并需要保存于-80摄氏度。相反，BP Clonase II和LR Clonase II分别提供预混的BP Clonase/LR Clonase和5X BP/LR反应缓冲液。这些预混的溶液更加稳定，可以保存在-20摄氏度。
LR Clonase Plus和LR Clonase II Plus之间的区别在哪里？
LR Clonase Plus已经停产并被LR Clonase II Plus替代。LR Clonase II Plus针对多位点Gateway重组反应进行了特别优化。LR ClonasePlus之前带有5X LR反应缓冲液，包装于单独的试管中并需要保存于-80摄氏度。LR Clonase II Plus提供预混于同一试管中的LR Clonase Plus和5X LR反应缓冲液。预混的溶液更加稳定，可以保存在-20摄氏度。多位点Gateway LR Clonase II Plus实现效率最高的多位点重组反应。您可以使用LR Clonase II Plus进行单片段重组，但是您不能使用标准的LR Clonase或LR Clonase II进行多位点重组反应。
可以在PCR引物末端添加attL位点以直接重组到目的载体上吗？
不行，这并不可行，因为attL序列长度大约为100 bp，这对于高效合成寡核苷酸来说太长了，并且这将影响PCR反应。相反，attB序列仅有25 bp长，这是一个很合适的长度，可以将其加到基因特异性PCR引物的5'末端。
我可以构建一个单独入门载体并和带有N-末端标记和C-末端标记的DEST载体一起使用吗？
不能，因为N-末端标签的目的载体需要有一个终止子，而终止子的存在将阻断C-末端标签的表达。
我想从Gateway载体上很容易地切下插入片段，你们有推荐的限制性内切酶位点吗？
attB和attL位点的核心区含有限制性内切酶BsrG1的识别序列。因此，我们推荐使用BsrG1从Gateway载体上切下插入片段并用以验证BP和LR反应是否成功。BsrG1的识别序列是TGTACA。只要插入片段内没有BsrGI位点，则该酶便可以用来从大多数Gateway质粒上切下整个插入基因。插入片段可以从除了pDONR P4/P1R之外的所有pENTR和pDONR载体上释放出来，pDONR P4/P1R是3片段多重Gateway系统的一部分，它含有一个与attL1和attL2序列不同的attL4位点。如果需要其它的限制性酶切位点，则需要使用PCR将适当的序列加入到插入片段中。
你们出售带有Gateway兼容的植物载体吗？
我们不提供任何植物目的载体，但是您可以使用Gateway载体转化试剂盒（货号11828-029）改造Gateway兼容的植物表达载体。作为一项客户定制服务，我们提供pDONR P3-P4和pDONR P5-P6载体。每种载体10 µg，并且两种载体必须同时订购。如果您对这一服务感兴趣，请发送e-mail到custom.services@lifetech.com
为什么供体和入门载体含有两个转录终止序列？
供体载体和入门载体含有两个转录终止序列（rrnB T1和T2），分别位于attP1或attL1或attR1上游。这可以避免载体上其他启动子转录克隆的目的基因，从而降低了可能的毒性效应。
为什么pCR8/GW/TOPO载体带有壮观霉素抗性？你们有壮观霉素出售吗？
pCR8/GW/TOPO入门载体使用壮观霉素抗性进行筛选，以便生成的入门克隆可以和任意目的载体配合使用。尽管少数几个目的载体带有卡那霉素抗性或Zeocin抗性，大多数目的载体都是带有氨苄抗性的。否则的话，如果不预先对入门载体线性化，背景将会过高。壮观霉素是一个较不常用的筛选标记。我们不提供壮观霉素；盐酸壮观霉素Sigma有售，货号S4014。
如何对目的载体进行线性化以及线性化有必要吗？
我们以前建议将目的载体线性化以获得更高效的重组。但是，我们自己进一步的测试发现获得最佳结果并不需要进行线性化。如果目的载体太大（>10 kb），则将其线性化会有帮助。我们建议通过对位于Gateway元件区域内的限制性酶切位点进行切割使目的载体线性化，注意避免破坏ccdB基因。
如何将我的基因从现在的目的载体转移到一个新的目的载体中？
您需要与一个供体载体进行一次BP反应，然后再与新的目的载体进行一次LR反应。
我正在克隆我的目的基因到pENTR/SD/D-TOPO载体中，但我计划在E. coli和哺乳动物细胞中该基因均能表达。这种情况下，Shine-Dalgarno序列会干扰基因在哺乳动物细胞内表达吗？
不会，如果配合合适的哺乳动物DEST载体使用，则Shine-Dalgarno序列不会对基因在哺乳动物细胞内表达产生负面影响。
我正在使用Gateway转化试剂盒使我自己的载体变成gateway兼容的载体。A, B,以及C读码框元件之间的区别在哪里？
A, B,以及C读码框元件之间各相差一个核苷酸，以便配合在所有3个读码框内都能生成attR位点。每个读码框元件都包含一个独特的限制性酶切位点，以便您对它们进行区分（请参见用户手册第3页的表格）。
如果Vector NTI软件不能识别用于Gateway克隆的载体，该如何解决
以下是一些需要检查的事项：
Att位点必须被正确的标记为Miscellaneous Recombination特征类型（attR1或attR2也是一样）；ccdB CDS必须在载体上被注释（为“ccdB”），并且载体必须是环状的。如果该质粒仍然没有被识别为Gateway克隆，则请将其att位点的序列和一个与其类似但被识别为Gateway载体的att位点序列进行比较。如果有一些点突变，则请根据被识别载体上的序列编辑不被识别的载体上的att序列。然后继续在Vector NTI程序内进行Gateway克隆。上述单核苷酸差异在所有att位点内都是非关键核苷酸，但是旧版的Vector NTI程序对识别Gateway克隆载体有严格的要求。
Gateway克隆和表达需满足的先决条件是什么？
目的基因必须两端带有合适的att位点，或者是入门克隆中的attL (100 bp)位点，或者是PCR产物中的 attB (25 bp)位点。对于入门克隆而言，所有位于attL位点之间的部分都将被转移到含有attR位点的Gateway目的载体中，而两端带有attB位点的PCR产物需被转移到一个含有attP位点的供体载体，例如pDONR™221。翻译起始位点的位置，终止子，或者用于表达的融合标签必须在最开始的克隆设计中考虑到。例如，如果您的目的载体包含一个N末端标记而非C末端标记，则该载体应当已经带有合适的翻译起始位点，但是终止子应当被包含在插入片段当中。
Gateway克隆插入片段的长度有什么限制吗？
理论上没有片段大小限制。长度在100 bp到11 kb之间的PCR产物可以被直接克隆到pDONR™ Gateway载体中。其它DNA片段如带有att位点的150 kb DNA片段可以成功和一个Gateway兼容载体发生重组。对于大的插入片段，推荐进行过夜孵育反应。
Library Efficiency DB3.1已经停产了。是否有替代品用于扩增包含ccdB基因的质粒？
我们提供 One Shot ccdB Survival™ 2 T1R细胞（货号A10460）用于扩增包含ccdB的质粒。
Gateway兼容的TOPO载体同时提供一个对照模板和对照引物。可否提供对照模板的序列吗？ 对照模板的序列是受专利保护的。
是否提供用于在植物内表达的Gateway载体吗？ 我们不提供任何用于在植物内表达的Gateway载体。
我可以单独购买5X LR Clonase缓冲液或5X BP Clonase缓冲液吗？ 5X LR Clonase缓冲液或5X BP Clonase缓冲液不作为单独产品出售。它们作为酶试剂盒的一部分进行销售。
如果丢失了入门克隆，如何将目的基因从一个Gateway兼容的表达克隆转移到一个新的目的载体？
建议使用一个供体载体进行一次BP反应以获得一个入门克隆。然后将这一入门克隆和目的载体进行一次LR反应以获得新的表达克隆。
有推荐的一步式BP/LR重组实验方案吗？ 有的，我们能提供针对BP/LR Clonase反应的一步克隆实验方案DNA可以在一步反应后被克隆到目的载体中，从而节省了您的时间和金钱。
可以使用BP Clonase酶和LR Clonase酶替代BP Clonase II 酶LR Clonase II酶进行BP/LR Clonase反应的一步法实验方案吗？ 在BP/LR Clonase反应的一步法实验方案中，不建议用BP Clonase酶和LR Clonase酶替代BP Clonase II 酶/LR Clonase II酶，因为这样的重组效率非常低。
蛋白酶K应该如何储存？ 建议将其储存在4°C。
用于Gateway克隆反应的DNA的纯度有要求吗？
小抽（碱裂解）纯化的DNA即适用在Gateway克隆反应中。重要的一点是要将RNA污染去除干净以便得到精确的定量。推荐使用通过我们的S.N.A.P.™ 核酸纯化试剂盒，ChargeSwitch试剂盒，或PureLink试剂盒纯化的质粒DNA。